توالی یابی

توالی‌یابی، در علم ژنتیک و بیوشیمی، به معنی تعیین ساختار داخلی یک بسپار (نظیر ترتیب نوکلئوتیدهای سازندهدی‌ان‌ای) است. نتیجه ی این فرایند، دستیابی به توالی ساختارهای مختلف اتمی در بسپار است که نمایانگر ساختار توالی مولکول در سطح اتمی میباشد.

تکنیکهای تعیین توالی نوکائوتید های DNA

1)روش شبمیایی (ماکسام-گیلبرت): این روش با استفاده از آنزیم،عملی میباشد و برای آن به نسخه های متعددی از یک قطعهANA نیاز است. ابتدا فسفات 5ٰیا3ٰ انتهایی نشاندار می شود،سپس بوسیله ی اندونوکلئاز محدودالاثر،DNAA به دو قطعه ی نامساوی تبدیل می شود که هریک دارای یک فسفر نشاندار است. در مرحله بعد ، دورشته از هم جدا می شوند و توسط الکتروفورز قطعات از هم جدا می شوند. در نهایت به روش شیمیایی خاصی نوکلئوتید ها را جدا نموده و توالی DNA را تعیین می کنند.

2)روش خاتمه ی زنجیره (سانجر): در این روش به قطعات DNA اجازه همانندسازی توسط پلیمراز داده میشود. سپس ترکیب 3ٰ،2ٰ دو دزوکسی ریبونوکلئوزیدتری فسفات (ddNTP) که باز آلی تغییر شکل یافته است به انتهای رشته DNAA اضافه میگردد.این کار باعث توقف  همانندسازی میشود.روش توالی­یابی DNAی سنگر با استفاده از دی­دئوکسی نوکلئوتیدها برای خاتمه دادن سنتز DNA، یک­سری از قطعات DNA را ایجاد می­کند که اندازه آن­ها می­تواند به­وسیله الکتروفورز تعیین شود. آخرین باز هر یک از این قطعات مشخص می­باشد، زیرا ما می­دانیم که در هر واکنش خاتمه از کدام دی­دئوکسی نوکلئوتید استفاده شده ‌است. بنابراین، با مرتب کردن این قطعات براساس اندازه‌شان-هر قطعه یک باز (مشخص) طویل­تر از قطعه‌ی بعدی- توالی بازی DNA را به ما نشان می­دهد.تصویر بالا جزئیات این روش را نشان میدهد.

(انیمیشن های زیادی برای توضیح این روش تهیه شده که باجستجو در وب میتوانید آنها را پیدا کنید)

3)روش خشک کن ساترن (southern blotting): در این روش از قطعات DNA شناساگر(probe) برای هیبرید شدن آن با DNAA مورد نظر استفاده می شود. پروب،قطعه اسیدنوکلئیک دارای توالی مکمل با DNAالگو است وهرگاه لازم باشد تا ژن خاصی در بین مجموعه ای از ژن ها پیگیری و یافت شود از پروب یا شناساگر استفاده می شود تا آنرا نشاندار کند. (برای شناسایی RNAوپروتئین ها نیز روش های مشابه ساترن بلات وجود دارد.

 4)استفاده از کیت های توالی یابی : امروزه تعیین توالی DNA برای کارهای صنعتی و تحقیقاتی با استفاده از کیت های آماده بسیار ساده می باشد. این کیت ها محتوی معرف های پیش مخلوط (premixedd) بوده و دستورالعمل های خاصی در خصوص چگونگی استفاده از آنها را نیز دارند . این معرف ها دارای کد های رنگی می باشند بنابراین برای استفاده به مهارت خاصی نیاز ندارند. البته دانستن برخی از مطالب اساسی برای کار با این کیت ها لازم است.