توالییابی، در علم ژنتیک و بیوشیمی، به معنی تعیین ساختار داخلی یک بسپار (نظیر ترتیب نوکلئوتیدهای سازندهدی‌ان‌ای) است. نتیجه ی این فرایند، دستیابی به توالی ساختارهای مختلف اتمی در بسپار است که نمایانگر ساختار توالی مولکول در سطح اتمی میباشد.
تکنیکهای تعیین توالی نوکائوتید های DNA
1)روش شبمیایی (ماکسام-گیلبرت): این روش با استفاده از آنزیم،عملی میباشد و برای آن به نسخه های متعددی از یک قطعهANA نیاز است. ابتدا فسفات 5ٰیا3ٰ انتهایی نشاندار می شود،سپس بوسیله ی اندونوکلئاز محدودالاثر،DNAA به دو قطعه ی نامساوی تبدیل می شود که هریک دارای یک فسفر نشاندار است. در مرحله بعد ، دورشته از هم جدا می شوند و توسط الکتروفورز قطعات از هم جدا می شوند. در نهایت به روش شیمیایی خاصی نوکلئوتید ها را جدا نموده و توالی DNA را تعیین می کنند.
2)روش خاتمه ی زنجیره (سانجر): در این روش به قطعات DNA اجازه همانندسازی توسط پلیمراز داده میشود. سپس ترکیب 3ٰ،2ٰ دو دزوکسی ریبونوکلئوزیدتری فسفات (ddNTP) که باز آلی تغییر شکل یافته است به انتهای رشته DNAA اضافه میگردد.این کار باعث توقف همانندسازی میشود.روش توالییابی DNAی سنگر با استفاده از دیدئوکسی نوکلئوتیدها برای خاتمه دادن سنتز DNA، یکسری از قطعات DNA را ایجاد میکند که اندازه آنها میتواند بهوسیله الکتروفورز تعیین شود. آخرین باز هر یک از این قطعات مشخص میباشد، زیرا ما میدانیم که در هر واکنش خاتمه از کدام دیدئوکسی نوکلئوتید استفاده شده است. بنابراین، با مرتب کردن این قطعات براساس اندازه‌شان-هر قطعه یک باز (مشخص) طویلتر از قطعه‌ی بعدی- توالی بازی DNA را به ما نشان میدهد.تصویر بالا جزئیات این روش را نشان میدهد.
(انیمیشن های زیادی برای توضیح این روش تهیه شده که باجستجو در وب میتوانید آنها را پیدا کنید)
3)روش خشک کن ساترن (southern blotting): در این روش از قطعات DNA شناساگر(probe) برای هیبرید شدن آن با DNAA مورد نظر استفاده می شود. پروب،قطعه اسیدنوکلئیک دارای توالی مکمل با DNAالگو است وهرگاه لازم باشد تا ژن خاصی در بین مجموعه ای از ژن ها پیگیری و یافت شود از پروب یا شناساگر استفاده می شود تا آنرا نشاندار کند. (برای شناسایی RNAوپروتئین ها نیز روش های مشابه ساترن بلات وجود دارد.
4)استفاده از کیت های توالی یابی : امروزه تعیین توالی DNA برای کارهای صنعتی و تحقیقاتی با استفاده از کیت های آماده بسیار ساده می باشد. این کیت ها محتوی معرف های پیش مخلوط (premixedd) بوده و دستورالعمل های خاصی در خصوص چگونگی استفاده از آنها را نیز دارند . این معرف ها دارای کد های رنگی می باشند بنابراین برای استفاده به مهارت خاصی نیاز ندارند. البته دانستن برخی از مطالب اساسی برای کار با این کیت ها لازم است.
در این نوع از سرطان پستان، سلول های سرطانی فاقد سه نوع رسپتوری هستند که به طور معمول توسط داروهای شیمیایی شناسایی می شوند؛ بنابراین این داروها توانایی پیدا کردن این نوع از سلول های سرطانی را ندارند و پزشکان مجبور به استفاده از درمان های تهاجمی‌تر بوده که اثرات سمی آنها بیشتر است.
زنان مبتلا به این نوع سرطان به‌طور ناگهانی دچار متاستاز می شوند که منشأ و علت آن مقاومت دارویی ایجاد شده در سلول های سرطانی است؛ بنابراین نیاز به درمان های ایمن و کارآمدتر احساس می شود.
بر طبق آزمایش های انجام شده میزان متاستاز سلول های سه‌گانه منفی پستان در ریه موش ها بطور قابل‌توجهی کاهش یافته است و این در حالی است که در موش ها کاهش وزن مشاهده نشده که خود دلیلی بر غیر سمی بودن لوتئین است. این نوع از سلول های سرطانی توانایی مهاجرت بالایی دارند که به متاستاز آنها کمک می کند؛ اما بر طبق یافته ها، میزان مهاجرت سلول های سه گانه منفی رده های انسانی در مجاورت لوتئین، در شرایط آزمایشگاهی نیز کاهش پیدا کرده است.
همچنین لوتئین توانایی کشتن سلول های سرطانی را دارد.
امید است که با تحقیقات بیشتر و در آینده نه چندان دور لوتئین به‌عنوان یک داروی ضد متاستاز (Antimetastatic agent) علیه سرطان پستان معرفی شود.
1- بهبود دادن اطلاعات: با همکاری وزارت انرژی آمریکا و موسسه ملی بهداشت، پروژه ژنوم انسان در ترویج رویه کنونی ارائه آنلاین و رایگان اطلاعات پیش گام به شمار می رود. این رویه شیوه ای تحقیقاتی را رواج داد که به محققان امکان می داد با سرعتی بالاتر از گذشته به اکتشاف بپردازند. به گفته "فرانسیس کالینز" رئیس موسسه ملی بهداشت و یکی از فعالان پیشین در ارائه توالی ژنوم انسان تنها مواردی که دانشمندان فعال در زمینه ژنوم انسان به آن نیاز دارند، اینترنت، مواد شیمیایی ارزان قیمت، ماشین چرخه ای حرارتی و دسترسی به یک ترتیب سنج دی ان ای است.
2- افزودن دی ان ای به "بسته منشاء انسانی": "مارک مک کارتی" از دانشگاه آکسفورد که بر روی دلایل ژنتیکی دیابت و چاقی مطالعه می کند، معتقد است پروژه ژنوم انسان ثابت کرد ژن ابزاری ارزشمند برای مطالعه بر روی منشا انسان و تاریخچه مهاجرتهای انسانهای پیشین به شمار می رود. با کمک اطلاعات این پروژه انسان توانسته است سن واقعی گونه خود و شباهتهای موجود میان بسیاری از انسانها را کشف کند، به ویژه جمعیتهای انسانی که منشا آنها به 70 هزار سال پیش از آفریقا باز می گردد. در عین حال اطلاعات ژنتیکی این پروژه نظریه های وابسته به باستان شناسی و زبان شناسی را نیز مورد حمایت و پوشش خود قرار داده است.
3- دستیابی به نشانه های منشاء ما قبل تاریخ بیماری ها: پروژه ژنوم به گونه ای به پایه و اساس پروژه های دیگری از قبیل HapMap که با هدف کشف SNPها یا چند شکلی های تک نوکلئوتیدی شکل گرفته بود تبدیل شد. SNPها تفاوتهای نشانه گذاری ژنها در میان اعضای یک گونه مشابه هستند و حروف مورد استفاده برای نشانه گذاری حروف A,T,C و G هستند. پروژه HapMap کاتالوگی از SNPهای رایج موجود میان انسانها است. این تفاوتها می توانند بر روی میزان آسیب پذیری انسانها در برابر بیماری هایی ویژه از جمله سرطان، بیماری های قلبی و دیابت تاثیرگذار باشد.
4- کشف کمبود ژن در دی ان ای انسان: قبل از آغاز پروژه ژنوم انسان، برخی از دانشمندان تخمین زده بودند سه بیلیون از حروف دی ان ای در تشکیل بیش از صدها هزار ژن نقش دارند اما اطلاعات به دست آمده از این پروژه نشان داد تعداد ژنهای موجود در ژنوم انسان از حد انتظار بسیار کمتر است. این پروژه نشان داد ژنوم انسان دارای 20 هزار تا 25 هزار ژن است و این به آن معنی است که هر یک از ژنها از پیچیدگی های بسیار زیادی برخوردارند. به گزارش مهر، به دلیل محدودیت حروف دی ان ای استفاده شده در هر ژن مشخص شد در حدود 98.5 درصد از دی ان ای انسان با ژنها در ارتباط نیست و از این رو برخی این بخش را "دی ان ای زباله" می نامند.
5- تحقیقات ژنتیکی بیشتر: از دیگر دستاوردهای پروژه ژنوم انسان، پرورش دادن نسلهای جدیدتر، سریعتر و ارزان قیمت تری در توالی ژنتیکی بوده است. توالی ژنتیکی که 10 سال پیش از ژنوم انسان به دست آمد اکنون به عنوان مرجعی برای مقایسه اطلاعات به دست آمده از شیوه های جدید رمزگشایی ژنوم انسان مورد استفاده قرار می گیرد.
پیش بینی 10 سال آینده مطالعات ژنتیکی
1- کشف منشاء دقیق انسان: دانشمندان در آینده ای نه چندان دور قادر خواهند بود با مقایسه ژنوم انسانهای مدرن با دیگر گونه ها منشا دقیق انسانها را در تاریخ کشف کنند.
2- ژن درمانی بیماری های را ریشه کن خواهد کرد: این شیوه درمانی، درمان با کمک جایگزینی ژنهای مختل، طی 10 سال آینده در نهایت به واقعیت تبدیل خواهد شد و بسیاری از بیماری های لاعلاج امروزی را درمان خواهد کرد.
3- تغییر مفهوم ژن: مفاهیم سنتی می گویند ژن منطقه ای از دی ان ای است که پروتئینها را رمزگذاری می کند. اما در سالهای اخیر دانشمندان موفق به کشف بخش زباله دی ان ای شده اند، بخشی که پروتئین نمی سازد اما در عین حال از اهمیت برخوردار است. به گزارش مهر، این کشف می تواند بیانگر این موضوع باشد که امکان تغییر مفهوم ژن با ادامه یافتن مطالعات ژنتیکی وجود خواهد داشت.
4- شخصی سازی ژنوم به واقعیت تبدیل می شود: متخصصان معتقدند با کمک گرفتن از جدیدترین فناوریها تا پنج سال آینده هر انسانی قادر خواهد بود به ازای کمتر از هزار دلار به توالی ژنتیکی خود دسترسی داشته باشد که این فرایند با گذشت زمان کم هزینه تر نیز خواهد شد.
5- تعیین شخصیت افراد به علم تبدیل می شود: با درک بهتر اطلاعاتی که در ژنوم انسان نهفته است، دانشمندان قادر خواهند بود بر روی تاثیرات فیزیکی و ذهنی ژنها بر روی انسانها اطلاعات بیشتری به دست آورند. به این شکل در آینده ای دور امکان تشخیص شکل ظاهری و خصوصیات رفتاری یک انسان تنها با کمک گرفتن از اطلاعات ژنتیکی وی امکان پذیر خواهد بود.
ارزیابی پرایمرها قبل از سنتز آنها
2- Standard Primers
تکثیر آمپلی کون مورد نظر بدون هیچ حذف و اضافه ای
تشخیص ویروس و باکتری
3- Degenerate Primers
شناسایی توالی نوکلئوتیدی ساختارهای کدکننده پروتئین ها و پپتیدها
4- Inverse Primers
شناسایی موقعیت insert ژنومی یا سکانس شناخته شده ای در ژنوم
مطالعه متاژنوم
5- cDNA Primers or RT-Specific Primers
شناسایی ویروس های RNAدار
تعیین مقدار ویروس موجود در بدن موجود زنده
بررسی سطح بیان ژنها
6- Cloning Specific primers
آماده سازی insertهابرای وارد نمودن در وکتور مناسب
7- Linker Primers
تکثیر توالی های شناسایی نشده
آماده سازی توالی های شناسایی نشده برای توالی یابی
8- Assembly Primers
سنتز توالی های طویل DNA
طراحی و تولید بیوسنسورها
9- Asymmetric Primers
توالی یابی
ساخت پروب
آپتامر
10- Multiplex Primers
تکثیر و شناسایی توالی های متعدد با انجام یک واکنش
11- MLPA Primers
تکثیر و شناسایی توالی های متعدد با یک جفت پرایمر با انجام یک یا چند واکنش
12- Nested Primers
تکثیر اختصاصی تر آمپلی کون نسبت به نوع استاندارد
کاهش زمینه نامطلوب تکثیر غیراختصاصی DNA
افزایش مقادیر کم الگو
13- SOEing Primers
اتصال اگزانها به هم و خارج سازی اینترانها
ایجاد ساختارهای کایمریک
14- پرایمرهای ARMS
شناسایی جهش یا بیماری ژنتیکی ناشی از تغییر توالی نوکلئوتیدی
تعیین نوع SNP
15- پرایمرهای ADLP
شناسایی جهش یا بیماری ژنتیکی ناشی از تغییر توالی نوکلئوتیدی
تعیین نوع SNP
16- پرایمرهای Dial-out
بازیابی مولکولهای DNA از کتابخانه DNA
17- پرایمرهای Intersequence
انگشت نگاری DNA
ارزیابی هوموزیگوت بودن یا هترزیگوت بودن
18- پرایمرهای SOEing
اتصال اگزانها به هم و خارج سازی اینترانها
ایجاد ساختارهای کایمریک
19- پرایمرهای BSP
شناسایی پروموترها
تعیین پروموتر بودن یا نبودن یک توالی
20- پرایمرهای MSP
شناسایی پروموترها
تعیین پروموتر بودن یا نبودن یک توالی
21- پرایمرهای Mini
تکثیر نواحی Conserved یا حفاظت شده DNA
22- پرایمرهای Solid
بررسی بیان ژن
23- پرایمرهای Genome Replication
افزایش تعداد نسخه های ژنوم
24- پرایمرهای Plasmid Replication
DSO-Nick
افزایش تعداد نسخه های پلاسمید
محققان چینی روشی ارائه کردند که با استفاده از آن می‌توان وجود سه نوع ویروس خطرناک یعنی، HIV، هپاتیت C و هپاتیت B را در بدن شناسایی کرد، با این روش جدید می‌توان در یک مرحله به وجود این ویروس‌ها پی برد.
سریع‌ترین روش برای شناسایی این ویروس‌ها، بررسی DNA و RNA آنها است، در این روش، برخلاف روشهای مبتنی بر آنتی‌بادی، نیاز به گذشت زمان زیاد و انتظار برای عکس‌العمل سیستم ایمنی بدن نیست.
نانوگیو هی و همکارانش از دانشگاه سوث وست از روشی موسوم به تکثیر DNA یا RNA ویروس استفاده کردند، با این روش می‌توان میزان ویروس را به حدی رساند که امکان ایجاد سیگنال را داشته باشد.
در ابتدا DNA ویروس‌ها تکثیر میشود، سپس محققان اسیدنوکلئیک ویژه ویروس موردنظر را که روی سطح نانوذرات مغناطیسی قرار گرفته است وارد محیط می‌کنند، در صورتی که DNA ویروس موردنظر در محیط وجود داشته باشد، نانوذرات شروع به نشر نور می‌کنند.
این نانوذرات، لومینسانس شیمیایی هستند، به این معنا که در صورت وجود مواد شیمیایی خاصی در محیط از خود سیگنال نوری ایجاد می‌کنند که نشانگر ویروس است، مزیت این روش آن است که می‌توان از آن برای شناسایی ویروس‌ها در غلظت‌های بسیار کم استفاده کرد، بدون این که تجهیزات طیف‌سنجی ویژه‌ای نیاز باشد.
این نانوذرات، مغناطیسی هستند بنابراین می‌توان آنها را به سادگی خالص‌سازی کرد، از این روش می‌توان به صورت خودکار استفاده کرد.
به گفته محققان این طرح ،این سامانه دارای پتانسیل‌های درمانی بسیاری در آینده خواهد بود.